Se a concentração de metano cair na semana seguinte ao início do fornecimento de uma ração de baixo metano, podemos afirmar que a ração foi a causa? O evento que ocorreu primeiro no tempo parece ligado ao resultado posterior, mas isso, por si só, não estabelece causalidade. No mesmo período, a temperatura pode ter caído, a configuração da ventilação pode ter mudado, o número de animais pode ter diminuído ou o consumo de ração e a produtividade podem ter se alterado. A calibração do sensor ou o local de medição também podem ter mudado.
Verificar uma relação causal significa estimar, por meio do desenho do estudo, o contrafactual: “o que teria acontecido com o metano nos mesmos animais ou na mesma fazenda se a ração não tivesse sido aplicada?”. Como não é possível manter o mesmo indivíduo, ao mesmo tempo, nas condições tratada e não tratada, usam-se grupo de comparação, alocação aleatória, desenho cruzado, medidas repetidas e modelos estatísticos.
Por que a comparação entre antes e depois costuma falhar
O desenho mais simples compara a média anterior à aplicação com a média posterior. É conveniente para a operação em campo, mas sobrepõe tendências sazonais ao efeito da ração. Se, por exemplo, o período de referência ocorrer no auge do verão e o período de aplicação no início do outono, estresse térmico, consumo e ventilação mudarão juntos. Mesmo que o metano diminua 10%, é difícil separar quanto dessa redução se deve à ração.
Também é preciso ter cuidado com a regressão à média. Se uma semana com valor de metano casualmente alto for adotada como linha de base, os valores seguintes podem voltar ao nível habitual mesmo sem intervenção. Por outro lado, se a deriva do sensor coincidir com a data de aplicação, poderá surgir um efeito falso. A explicação visual de que “a data da aplicação coincide com a queda no gráfico” serve para formular uma hipótese, não para determinar a magnitude do efeito.
Outra fonte de confusão é a escolha do indicador. g CH₄/dia, g CH₄/kg de ingestão de matéria seca, g CH₄/kg de leite e a média de ppm no estábulo respondem a perguntas diferentes. Se a ração reduzir o metano total, mas também diminuir o consumo ou a produção, a interpretação do desempenho ambiental e produtivo poderá ser diferente. As diretrizes da FAO LEAP para aditivos alimentares orientam a comparação do desempenho ambiental da cadeia de suprimentos, incluindo a produção e o uso do aditivo, por meio de uma abordagem consistente de avaliação do ciclo de vida. A redução de um único indicador de fermentação entérica não determina automaticamente o desempenho ambiental total.
Desenhos causais que podem ser usados em campo
A abordagem mais fácil de compreender é a de um grupo de comparação simultâneo. Indivíduos semelhantes são alocados aleatoriamente entre o grupo tratado e o grupo controle e observados no mesmo período e sob a mesma operação do estábulo. A alocação aleatória reduz a probabilidade de que tanto fatores conhecidos quanto diferenças individuais ainda não consideradas se concentrem em um dos grupos. Se houver poucos indivíduos, podem-se formar blocos com características importantes, como peso, número de partos, dias em lactação e produção, e fazer a alocação dentro de cada bloco.
Também existe o desenho cruzado, no qual cada indivíduo atua como seu próprio controle. Um grupo recebe primeiro a ração controle e depois a ração experimental; o outro recebe na ordem inversa. Isso pode reduzir as diferenças entre indivíduos, mas é necessário considerar o efeito residual, quando o efeito do tratamento anterior persiste no período seguinte. Deve-se prever um período suficiente de adaptação e, quando necessário, um período de washout, incluindo os efeitos de período e sequência na análise. Como a ração pode levar tempo para alterar o ambiente ruminal, não se deve tirar conclusões escolhendo apenas os primeiros dias após a aplicação.
Quando o tratamento é aplicado no nível da fazenda, considera-se um desenho em conglomerados que distribui várias fazendas entre os grupos tratado e de comparação. Tratar muitas observações de sensores de uma única fazenda como centenas de amostras independentes cria pseudorreplicação e infla o tamanho amostral. Se o tratamento é aplicado à fazenda, a unidade experimental pode ser a fazenda, com os indivíduos e as medições no tempo aninhados dentro dela.
Em operações comerciais onde a randomização não é viável, podem ser empregados desenhos quase experimentais, como diferenças em diferenças e séries temporais interrompidas. Contudo, esses métodos também exigem pressupostos, como o de que a fazenda comparadora seguiria a mesma tendência externa ou de que não houve outra intervenção simultânea. Esses pressupostos devem ser avaliados antecipadamente com gráficos e registros operacionais, e suas limitações precisam ser divulgadas.
O plano de medição deve ser compatível com o desenho experimental
As diretrizes do ICAR explicam que a adequação de câmaras respiratórias, SF₆, GreenFeed, sniffer, câmaras portáteis de acumulação e indicadores indiretos varia conforme o resultado necessário e as condições de campo. O mesmo equipamento nem sempre é a melhor escolha para um ensaio que busca emissões absolutas e para outro que pretende classificar indivíduos. Em vez de escolher primeiro o equipamento e adaptar a pergunta a ele, deve-se definir antes a variável de desfecho nº 1 e a exatidão necessária.
As medições não devem ficar concentradas apenas logo após uma alimentação específica do dia. As emissões de metano de ruminantes seguem padrões de alimentação e ritmos diários. O procedimento GreenFeed do ICAR apresenta princípios operacionais para distribuir as medições de visitas ao longo do dia e obter a concentração de fundo e o fluxo de ar quantitativo. Qualquer que seja o método, devem-se manter iguais entre os grupos tratado e controle as oportunidades de medição, o acesso ao equipamento e as regras para dados ausentes.
A exposição à ração também precisa ser medida. O fato de um ingrediente constar na formulação não significa que cada indivíduo tenha ingerido de fato a dose-alvo. Devem ser registrados o número do lote, a concentração na mistura, a quantidade fornecida, as sobras, os registros individuais de acesso, os dias de interrupção e as reações adversas. Selecionar depois apenas o grupo que consumiu como planejado pode criar viés de seleção ao excluir indivíduos com baixa adesão; por isso, a população da análise principal deve ser definida antecipadamente.
Critérios a acordar antes da análise
A variável de desfecho nº 1, os períodos de comparação, os critérios de exclusão, a disponibilidade mínima de dados, o modelo estatístico e o nível de significância devem ser documentados antes de se examinar os dados. Sempre que possível, o tamanho da amostra deve ser definido por cálculo de poder que considere não só o efeito esperado, mas também a variação entre indivíduos e entre dias e o erro de medição. Um resultado não significativo em uma amostra pequena não equivale a “não há efeito”; e mesmo um resultado significativo pode ser impreciso se a magnitude do efeito e o intervalo de confiança forem amplos.
Além do tratamento, a análise pode incluir covariáveis definidas antecipadamente, como valor basal, número de partos, estágio da lactação, ingestão de matéria seca, produção, clima e ventilação. Entretanto, controlar indiscriminadamente uma variável que mudou como consequência do tratamento pode remover parte do efeito real. É recomendável traçar antes o caminho causal para distinguir quais variáveis são fatores de confusão e quais são mediadoras.
Se, após obter um bom resultado em um indicador e período, forem continuamente alterados os subgrupos e os períodos para selecionar apenas resultados favoráveis, o problema de testes múltiplos aumenta. Uma análise exploratória deve ser identificada como tal e distinguida de um teste confirmatório. A reprodutibilidade do efeito precisa ser verificada também em outras estações, outras fazendas, outros lotes de ração e análises independentes.
Lista de verificação para execução
Inclua um grupo de comparação simultâneo ou uma comparação quase experimental válida que represente “o que ocorreria sem a ração”.
Especifique se a unidade experimental é o indivíduo, o estábulo ou a fazenda e evite pseudorreplicação.
Defina antecipadamente a alocação aleatória, a formação de blocos, a sequência cruzada e os períodos de adaptação e washout.
Registre a variável de desfecho nº 1 e sua unidade, o método de medição, o tamanho da amostra e as regras de exclusão e dados ausentes.
Registre também o consumo efetivo e o lote, a interrupção do fornecimento e os indicadores de produtividade e saúde.
Aplique o mesmo cronograma de medição e os mesmos critérios de qualidade aos grupos tratado e controle.
Relate em conjunto a magnitude do efeito, o intervalo de confiança, a disponibilidade dos dados e as análises de sensibilidade.
Diferencie a redução da fermentação entérica do desempenho ambiental por unidade de produto, da segurança e da produtividade.
Conclusão
O efeito causal de uma ração de baixo metano não surge de um único gráfico de antes e depois. É necessário criar uma condição controle comparável, separar as diferenças individuais das mudanças ao longo do tempo, verificar o consumo real e a qualidade da medição e definir as regras de análise antes dos resultados. Os ensaios em campo são mais complexos que os de laboratório, mas o ponto de partida da confiança é incorporar essa complexidade ao desenho e à análise, em vez de apagá-la dos registros. Somente resultados que passem por esse processo podem ir além de “mudaram juntos” e se aproximar da afirmação de que “a ração contribuiu para a mudança”.