如果饲喂低甲烷饲料后的下一周甲烷浓度下降了，能否说饲料就是原因？虽然先发生的事件与随后出现的结果在时间上看似相关，但这不足以建立因果关系。同一时期，气温可能降低，通风设置可能改变，饲养头数可能减少，采食量和生产性能也可能发生变化。传感器校准或测量位置也有可能已经改变。
确认因果关系，就是通过研究设计尽可能估计“如果不使用这种饲料，同一动物或同一农场的甲烷会怎样”这一反事实。现实中不可能让同一时间的同一个体同时处于处理与未处理状态，因此需要使用对照组、随机分配、交叉设计、重复测量和统计模型。
前后比较为何经常得出错误结论
最简单的设计是比较使用前后的平均值。这便于现场运行，却会使季节趋势与饲料效应重叠。例如，如果基线期处于盛夏，而使用期处于初秋，热应激、采食量和通风量都会一同变化。即使甲烷降低了10%，也很难区分其中有多少是饲料造成的。
还应注意均值回归。如果偶然把甲烷值较高的一周定为基线，此后的数值即使没有采取任何措施，也可能回到正常水平。反之，如果传感器漂移恰好与开始使用饲料的日期重合，就会产生虚假效应。“使用日期与曲线下降一致”这样的图形说明只能作为提出假设的依据，不能作为确定效应量的依据。
另一个容易混淆的问题是指标选择。g CH₄/日、g CH₄/kg干物质采食量、g CH₄/kg牛奶以及畜舍平均ppm回答的是不同问题。如果饲料在降低甲烷总量的同时也降低采食量或产量，那么环境绩效与生产绩效的解释可能不同。FAO LEAP的饲料添加剂指南要求用一致的生命周期评价方法，比较包括添加剂生产和使用在内的供应链环境绩效。仅凭一项消化道发酵指标下降，并不能自动确定整体环境绩效。
现场可采用的因果设计
最容易理解的方法是同期对照组。将相似个体随机分配到处理组和对照组，并在同一时期、相同畜舍运行条件下观察。随机分配不仅能降低已知因素集中于一组的可能性，也能降低未曾考虑到的个体差异集中于一组的可能性。如果个体数量较少，可以按体重、胎次、泌乳天数和产量等主要特征分组，然后在组内分配。
还可以采用个体作为自身对照的交叉设计。一组先饲喂对照饲料、后饲喂试验饲料，另一组则采用相反顺序。这种方法可以减少个体间差异，但必须考虑上一处理的效应延续至下一阶段的残留效应。应设置充分的适应期，并在需要时设置洗脱期，同时在分析中纳入时期效应和顺序效应。饲料改变瘤胃环境可能需要时间，因此不能只选用刚开始应用后的几天就下结论。
如果在农场层面实施处理，可考虑将多个农场分配至处理组和对照组的整群设计。如果把同一农场中大量传感器观测值当成彼此独立的数百个样本，就会出现人为夸大样本量的伪重复问题。若处理施加于农场，实验单位就可能是农场，而个体与时间测量则嵌套其中。
在无法随机化的商业现场，可以采用双重差分、中断时间序列等准实验设计。不过，这些方法也需要假设对照农场遵循相同的外部趋势，或者不存在其他同期干预。必须事先用图表和运行记录检查这些假设，并公开其局限。
测量计划必须与实验设计相匹配
ICAR指南说明，呼吸室、SF₆、GreenFeed、sniffer、便携式累积室和代理指标等测量方法是否适用，会随所需结果与现场条件而异。用于测定绝对排放量的试验和用于排列个体顺序的试验，并不总是以同一种设备为最佳选择。不要先选设备再勉强套用问题，而应先确定主要（第1）评价指标和所需精度。
测量不应只集中在每天某个特定的饲喂后时段。反刍动物的甲烷排放遵循饲喂和昼夜节律。ICAR的GreenFeed程序提出，应把访问测量分散到一天之中，并获得背景浓度与定量流量。无论采用哪种方法，处理组与对照组的测量机会、设备可及性和缺失值规则都必须保持一致。
饲料暴露也必须测量。饲料写入配方表，与个体实际摄入目标剂量并不是一回事。应记录批次号、配合浓度、饲喂量、剩余量、个体访问记录、停止日期和不良反应。如果事后只挑选按计划摄入的群体进行分析，就可能因排除依从性较低的个体而产生选择偏倚，因此应事先确定主要分析人群。
分析前应约定的标准
在查看数据前，先将主要（第1）结局变量、比较时期、排除标准、最低数据可用率、统计模型和显著性水平记录成文。在条件允许时，样本量不仅要考虑预期效应，还应通过纳入个体间和日间变异及测量误差的检验效能计算来确定。小样本中结果不显著，并不等同于“没有效应”；即使结果显著，如果效应量的置信区间很宽，也可能并不精确。
分析中除处理因素外，还可以纳入事先确定的协变量，如基线值、胎次、泌乳阶段、干物质采食量、产量、天气和通风。但如果不加区分地控制因处理而发生变化的变量，可能会消除部分真实效应。最好先绘制因果路径，区分哪些变量是混杂因素，哪些变量是中介因素。
如果在一个指标和一个时期得到理想结果后，不断改变亚组和时期，只选择有利结果，就会加剧多重检验问题。探索性分析应明确标注为探索性，并与验证性试验区分开。还应在不同季节、不同农场、不同饲料批次和独立分析中确认效应的可重复性。
执行检查清单
设置同期对照组或合理的准实验对照，以替代“没有使用饲料时”的状态。
明确实验单位是个体、畜舍还是农场，避免伪重复。
事先确定随机分配、分组、交叉顺序以及适应期和洗脱期。
登记主要（第1）结局变量及单位、测量方法、样本量、排除规则和缺失值规则。
同时记录实际采食量和批次、停止饲喂、生产性能与健康指标。
对处理组和对照组采用相同的测量日程和质量标准。
同时报告效应量、置信区间、数据可用率和敏感性分析。
区分消化道发酵的减少、单位产品环境绩效，以及安全性和生产性能。
结论
低甲烷饲料的因果效应并不能从一张应用前后曲线图中得出。必须建立可比较的对照状态，区分个体差异与时间变化，确认实际摄入和测量质量，并在看到结果之前确定分析规则。现场试验比实验室更复杂，但可信度的起点不是从记录中抹去这种复杂性，而是将其纳入设计与分析。只有通过这些程序的结果，才可能超越“二者一同变化”，接近“饲料对变化作出了贡献”这一主张。